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¿Cómo autoclavar o esterilizar correctamente?
El proceso de esterilización en un autoclave (esterilizador de vapor) puede ser muy difícil. Si, por ejemplo, se esterilizan líquidos o sólidos (instrumentos, cristalería, filtros, textiles) para su uso posterior en el laboratorio, el proceso de esterilización debe garantizar un producto reproducible y estéril en todo momento. Los productos esterilizados para su uso en el laboratorio no pueden someterse a pruebas de esterilidad, ya que están contaminados por la prueba y, por lo tanto, ya no pueden utilizarse en el laboratorio.
¿El autoclave óptimo para usted?
La validación de los procesos de esterilización por vapor es un tema cada vez más importante para garantizar resultados reproducibles de forma verificable. Además, los aspectos de seguridad deben tenerse en cuenta en la esterilización por vapor en general, pero especialmente en la esterilización de líquidos. La esterilización suele realizarse a una temperatura de 121 ⁰C. Esto corresponde a una presión de vapor de aproximadamente 2 bares. Estas altas temperaturas y la presión asociada pueden suponer un riesgo considerable para el usuario si el proceso de esterilización por vapor se diseña o realiza de forma incorrecta.
Esterilización de líquidos y residuos líquidos en botellas
La esterilización de líquidos es una de las tareas más exigentes del laboratorio. A veces, los procesos de esterilización pueden durar mucho tiempo, las botellas deben estar abiertas o, al menos, ventiladas, parte del líquido hierve, los líquidos pueden desbordarse e incluso las botellas pueden reventar. Otra cuestión que hay que plantearse es si los líquidos de los biberones alcanzan siquiera la temperatura de esterilización deseada (por ejemplo, 121 ⁰C) y cuándo pueden retirarse con seguridad del autoclave una vez finalizado el proceso de esterilización.
Si nos fijamos en un proceso de esterilización para líquidos, consta de tres fases:
- Fase de calentamiento y tiempo de ecualización (H)
- Fase de esterilización, por ejemplo 121⁰C durante 20 minutos (S)
- Fase de enfriamiento hasta una temperatura de extracción segura (C).
La figura 1 ilustra gráficamente cada una de las fases.
La línea azul representa la temperatura en el recipiente a presión del autoclave, la línea roja la temperatura en el líquido. Puede verse claramente que la temperatura deseada de 121 ⁰C se alcanza muy rápidamente en el recipiente a presión del autoclave, mientras que los líquidos de las botellas tardan bastante más en alcanzar la temperatura de esterilización. La energía térmica del vapor se transfiere a las botellas durante el tiempo de calentamiento mediante la condensación del vapor. Este proceso de condensación y la transferencia de calor asociada llevan cierto tiempo, lo que explica la diferencia de tiempo entre el simple calentamiento del recipiente presurizado y el calentamiento del propio líquido. El tiempo necesario para alcanzar las mismas temperaturas en el recipiente a presión del autoclave y en los líquidos se denomina tiempo de ecualización.
Muchos de los autoclaves que se utilizan hoy en día en los laboratorios todavía no están equipados con una medición de la temperatura en un recipiente de referencia. Por lo tanto, la temperatura exacta del líquido a esterilizar no se registra y no se puede utilizar para controlar el proceso de esterilización. Estos autoclaves inician el tiempo de esterilización cuando se alcanza la temperatura deseada en el recipiente a presión del autoclave. El tiempo de ecualización necesario para que los líquidos alcancen la temperatura deseada no se tiene en cuenta. Por lo tanto, los líquidos nunca alcanzan la temperatura de esterilización de 121 ⁰C, por ejemplo, lo que significa que el proceso de esterilización ya no es biológicamente eficaz. Dependiendo de la resistencia de los microorganismos a inactivar, sólo se inactivan parcialmente o no se inactivan en absoluto.
Figura 1 - Proceso de esterilización / fases
Medición de la temperatura en un recipiente de referencia
Mediante la medición de la temperatura en un recipiente de referencia utilizando un sensor de temperatura, se puede determinar la temperatura exacta del líquido que se va a esterilizar y también se puede utilizar para controlar el proceso de esterilización. El tiempo de esterilización sólo comienza cuando se ha alcanzado la temperatura de esterilización deseada en el líquido. Para ello, el recipiente de referencia se llena de agua. Es importante que el tamaño y el nivel de llenado del recipiente de referencia se correspondan con los del recipiente más grande lleno del líquido que se va a esterilizar.
Temperatura de extracción segura
El sensor de temperatura para la medición en un recipiente de referencia es, por tanto, necesario para garantizar que se alcanza la temperatura de esterilización en el líquido. Sin embargo, también es necesario para garantizar una temperatura de extracción segura después de la esterilización. En un autoclave, los líquidos se calientan muy por encima del punto de ebullición normal (100 ⁰C). El calor introducido en el líquido, combinado con la sobrepresión asociada, puede suponer riesgos considerables para el operador de un autoclave. Por ejemplo, puede producirse un retraso en la ebullición, lo que significa que el líquido empieza a hervir espontáneamente cuando se abre el autoclave. Esta ebullición espontánea crea una onda de presión de vapor y líquido caliente que sale disparada de los recipientes, similar a un géiser. 1 litro de agua produce 1.000 litros de vapor.
Debido a este considerable potencial de peligro, los esterilizadores de vapor utilizados para esterilizar líquidos están sujetos a la normativa correspondiente. La norma DIN EN 61010-2-040 exige que los esterilizadores de vapor para la esterilización de líquidos estén equipados con dispositivos de seguridad que impidan la apertura del autoclave hasta que los líquidos se hayan enfriado a una temperatura de extracción segura para el usuario. La norma define la temperatura de extracción segura como 20 K por debajo del punto de ebullición del agua a presión atmosférica. Esto corresponde a una temperatura de extracción segura de 80 ⁰C. Los autoclaves modernos están equipados con un bloqueo de puerta dependiente de la temperatura y la presión. Esto impide que el autoclave se abra mientras el recipiente a presión esté presurizado y mientras la temperatura medida en el líquido sea superior a los 80 ⁰C requeridos.
Enfriar los líquidos hasta la temperatura de extracción segura puede llevar mucho tiempo. Un tamaño comúnmente utilizado para autoclaves en laboratorios es un autoclave con una capacidad de recipiente a presión de aproximadamente 150 litros. Si un autoclave de este tipo está totalmente cargado con botellas que contienen el líquido que se va a esterilizar, un ciclo de esterilización completo puede durar hasta 10 horas. Esto significa que ni siquiera se puede completar un proceso de esterilización en una jornada laboral. Por lo tanto, es aconsejable equipar el autoclave con un sistema de re-enfriamiento, que reduce significativamente el tiempo total del lote y elimina más peligros e inconvenientes a la hora de esterilizar líquidos.
Refrigeración rápida: máxima productividad y seguridad
Existen dos tipos básicos de sistemas de refrigeración disponibles para autoclaves.
- Enfriamiento por evaporación - hirviendo el líquido en la fase de enfriamiento
- Enfriamiento por radiación - irradiando el calor del líquido; el líquido no hierve en este sistema de enfriamiento.
La refrigeración porevaporación es probablemente el tipo de refrigeración más utilizado en un autoclave. Pueden ser, por ejemplo
- Autoenfriamiento por liberación lenta de vapor
- Enfriamiento por ventilación: el aire frío del ambiente se introduce en el recipiente a presión desde el exterior por medio de un ventilador
- Refrigeración por agua sin presión de apoyo
Todos los tipos de enfriamiento anteriores presentan serias desventajas a la hora de esterilizar líquidos y, si el proceso de esterilización no se realiza correctamente, pueden suponer un riesgo potencial considerable, ya que este tipo de enfriamiento requiere que el líquido se enfríe hasta hervir.
- La ebullición del líquido durante la fase de enfriamiento hace que se pierda parte del líquido. La pérdida de líquido prevista suele oscilar entre el 3 y el 10%, pero puede ser significativamente mayor en función de los ingredientes del líquido. Especialmente si el contenido proteínico del líquido es alto, tiende a hervir más, lo que aumenta la pérdida de líquido.
- Como los líquidos tienen que hervir para enfriarse, existe una alta probabilidad de que se desborden. Por este motivo, las botellas sólo se llenan hasta un tercio o la mitad para evitar el desbordamiento. Por un lado, esto supone una pérdida considerable de productividad, ya que se pierde entre el 50 y el 70% de la capacidad disponible (en las botellas). En segundo lugar, el desbordamiento no puede evitarse de forma fiable. Si los líquidos se desbordan, hay que limpiar el autoclave con mucho esfuerzo, hasta el punto de que los líquidos a base de agar, por ejemplo, pueden entrar en el sistema de tuberías (desagüe) del autoclave y bloquearlo cuando el agar se enfría y se solidifica allí. La limpieza del sistema de tuberías a menudo sólo es posible a costa del fabricante del autoclave.
- La ebullición del líquido sólo es posible a partir de botellas abiertas. Por lo tanto, las botellas deben estar abiertas o al menos ventiladas (tapa ligeramente abierta). Si las botellas no están ventiladas o no lo están correctamente, el líquido contenido en ellas no podrá hervir durante la fase de enfriamiento y, por lo tanto, no se enfriará. Si el recipiente de referencia ha alcanzado la temperatura de enfriamiento de 80⁰C y, por tanto, permite abrir el autoclave, la(s) botella(s) herméticamente cerrada(s) sigue(n) a la temperatura de esterilización con la presión correspondiente, por ejemplo, 121⁰C, 2 bares. Esto supone un riesgo considerable, ya que estas botellas pueden explotar al descargar el autoclave y el líquido que contienen puede vaporizarse espontáneamente, de forma similar al retardo de ebullición. ¡1 litro de agua produce 1000 litros de vapor!
Por lo tanto, a la hora de adquirir un autoclave, conviene definir exactamente para qué aplicaciones se utilizará y cómo debe equiparse en términos de productividad y seguridad.
Enfriamiento por radiación
El enfriamiento por radiación (enfriamiento rápido con presión de apoyo) presenta ventajas considerables con respecto al enfriamiento por evaporación. Con el enfriamiento rápido con presión de apoyo, toda la superficie del contenedor presurizado se enfría con agua fría mediante serpentines de refrigeración externos. Antes de activar la refrigeración tras la fase de esterilización, el vapor del recipiente a presión se sustituye por aire comprimido filtrado estérilmente. El aire comprimido impide de forma fiable que el líquido hierva durante la fase de refrigeración. El calor se transfiere del líquido a las paredes frías del recipiente a presión por radiación, enfriando así el líquido.
El enfriamiento rápido con presión de apoyo permite aumentar considerablemente la productividad, ya que los tiempos de proceso se reducen notablemente en comparación con el autoenfriamiento. Mientras que el autoenfriamiento sigue necesitando hasta 10 horas para un proceso completo de autoclave, el tiempo de enfriamiento puede reducirse hasta un 60% con el enfriamiento rápido con presión de apoyo, dependiendo de la cantidad de carga. Además, todos los riesgos e inconvenientes descritos para la refrigeración por evaporación (retraso de la ebullición, pérdida de líquido, desbordamiento, ausencia de refrigeración para botellas bien cerradas) se eliminan de forma fiable, ya que el líquido deja de hervir. Con este tipo de refrigeración, las botellas pueden llenarse hasta el nivel de llenado máximo (aumento de la productividad del 50 al 70%) e incluso pueden utilizarse botellas herméticamente cerradas. No es necesario abrir ni cebar las botellas.
Optimizar aún más los tiempos de proceso
Los autoclaves modernos ofrecen la posibilidad de optimizar aún más el enfriamiento de líquidos en módulos. Esto aumenta aún más la productividad, pero también repercute en la calidad de los líquidos a esterilizar. Muchos líquidos contienen ingredientes que no son muy estables al calor. Aunque los líquidos deben esterilizarse, el tiempo durante el cual se exponen al calor debe ser lo más breve posible para que los ingredientes termoestables no se vean afectados negativamente.
Módulo 1 - Ventilador centrífugo
Durante la fase de enfriamiento, el ventilador radial genera un flujo de aire en el recipiente a presión del autoclave. Este flujo de aire empuja el calor de las botellas hacia las paredes del recipiente presurizado, que se enfrían gracias al rápido enfriamiento con presión de apoyo. Este proceso puede reducir el tiempo de enfriamiento hasta en un 70% en comparación con el autoenfriamiento.
Figura 4 - Enfriamiento con presión de apoyo y ventilador radial
Módulo 2 - Ultracooler
El Ultracooler es un intercambiador de calor adicional refrigerado por agua que se integra directamente en el recipiente a presión del autoclave. Esto permite extraer el calor de las botellas directamente donde se encuentra: en el recipiente a presión. Gracias a la transferencia de calor significativamente mejorada, el tiempo de enfriamiento puede reducirse hasta en un 90% en comparación con el autoenfriamiento.
Nota: Como el ventilador radial y el ultraenfriador están instalados dentro del recipiente a presión, hay que tener cuidado de que no reduzcan el espacio útil disponible del autoclave.
Esterilización de sólidos y residuos en bolsas de destrucción
Al esterilizar sólidos (por ejemplo, instrumentos, cristalería vacía, puntas de pipeta en cajas, filtros y textiles) y al destruir residuos en bolsas de destrucción, se debe tener cuidado para garantizar que se crea una atmósfera de vapor exactamente donde se necesita. Es decir, sobre y dentro del producto que se va a esterilizar. Muchos autoclaves no eliminan de forma fiable el aire del autoclave y del producto. Cuando el aire permanece en el autoclave y en el producto, no hay efecto esterilizador, ya que sólo el vapor transporta la energía térmica necesaria que inactiva los microorganismos de forma fiable.
Ventilación ineficaz
Las figuras 5 y 6 muestran la ventilación ineficaz utilizando el ejemplo de una caja con puntas de pipeta y una bolsa de destrucción. Si el autoclave simplemente se calienta, el aire se desplaza del mismo y se crea una atmósfera de vapor en el recipiente a presión del autoclave, mientras que el aire permanece en el producto a esterilizar. El aire que permanece en el producto impide que el vapor penetre allí donde se necesita su energía calorífica para lograr un efecto esterilizador.
El aire a la misma temperatura que el vapor (por ejemplo, 121 ⁰C) contiene muchas veces menos energía térmica. Para los productos que no pueden esterilizarse en una atmósfera de vapor, existen esterilizadores de aire caliente, pero éstos esterilizan a temperaturas más altas (180 a 250 ⁰C) y durante mucho más tiempo (hasta varias horas de esterilización). Por lo tanto, el efecto esterilizador del aire a las temperaturas que se suelen utilizar en los esterilizadores de vapor, de 121 ⁰C a 134 °C, y con un tiempo de esterilización de 3 a 20 minutos es prácticamente inexistente.
Figura 5 - Ventilación ineficaz para sólidos
Ventilación eficaz
Se debe utilizar un prevacío fraccionado para la eliminación completa y reproducible del aire del autoclave y del producto a esterilizar. Para ello, el autoclave está equipado con un sistema de vacío. Durante la fase de calentamiento, se utilizan ciclos de vacío para eliminar activamente el aire, seguidos de ráfagas de vapor. Por regla general, se utiliza un prevacío de triple fraccionamiento, pero pueden ser necesarias más fracciones en función del producto.
Secado de sólidos - Superdry
Para el secado, los sólidos como instrumentos o cristalería vacía suelen colocarse en un armario de secado después del proceso de esterilización. Los autoclaves modernos permiten secar los sólidos directamente después del proceso de esterilización. Esterilización y secado en un solo proceso. No es necesaria una manipulación posterior del material de esterilización con riesgo de recontaminación.
Esterilización de sustancias biológicas peligrosas
La esterilización de sustancias biológicas peligrosas constituye un reto especial. Durante la fase de calentamiento, el aire del autoclave se sustituye por vapor. Para ello, el aire se desplaza del autoclave y se libera en la sala en la que está instalado el autoclave.
TRBA 100 - Normas Técnicas para Agentes Biológicos - exige que el aire de salida de un autoclave en laboratorios sea tratado a partir del nivel de seguridad S2, ya que este aire de salida podría estar contaminado por microorganismos procedentes del producto a esterilizar. Para ello, debe utilizarse un proceso adecuado. En el caso de los autoclaves, éste suele ser la filtración. Para ello, el autoclave está equipado con un filtro de aire de salida. Todo el aire expulsado del autoclave se canaliza a través del filtro y los microorganismos quedan retenidos en él. El filtro se esteriliza "en línea" durante el proceso de esterilización para inactivar los microorganismos retenidos en él. El TRBA 100 sólo se ocupa del aire de salida del autoclave, pero no del condensado producido. Durante el proceso de esterilización, el vapor se condensa en el producto y se convierte en agua (condensado). Esta agua también puede estar potencialmente contaminada por microorganismos. Por lo tanto, el condensado debe permanecer en el autoclave durante el proceso de esterilización y también debe ser esterilizado "en línea" antes de ser descargado en el desagüe después de una esterilización exitosa.
Cualificación y validación
Durante la cualificación, se comprueba si un dispositivo es adecuado para el uso previsto y si un proceso, por ejemplo un proceso de esterilización, puede llevarse a cabo siempre con el mismo resultado (reproducible), un producto estéril, teniendo en cuenta el producto que se va a esterilizar.
En principio, el proceso de cualificación se divide en tres partes principales:
- IQ - Cualificación de la instalación
Comprobación de si un dispositivo se ha fabricado e instalado de acuerdo con las especificaciones. - OQ - Cualificación funcional
Comprobación de si un dispositivo funciona básicamente de acuerdo con las especificaciones. - PQ - Cualificación del rendimiento
Comprobación de si un dispositivo con un producto que se va a procesar funciona de acuerdo con las especificaciones.
El objetivo de la cualificación y la validación es proporcionar una prueba documentada de que un dispositivo es adecuado para el uso previsto.
El efecto esterilizante de un proceso de esterilización por vapor se verifica en la OQ (cámara vacía) y en la PQ (con producto) utilizando equipos de medición externos para la temperatura y la presión y con la ayuda de bioindicadores basados en Bacillus stearothermophilus. Mientras que los dispositivos externos de medición de la temperatura y la presión proporcionan la prueba de que el sistema de control del autoclave muestra y documenta valores fiables y realiza el proceso de esterilización dentro de las tolerancias definidas, los bioindicadores proporcionan la prueba biológica de la eficacia. Para la colocación de los bioindicadores, es necesario determinar en qué zonas de los objetos a esterilizar es más difícil alcanzar la eficacia biológica. Es precisamente en estas zonas donde deben colocarse los bioindicadores para cubrir el "peor de los casos", por así decirlo. Todos los pasos de un IQ, OQ y PQ deben documentarse detalladamente. En cualquier caso, es necesaria una estrecha coordinación entre el usuario y el fabricante a la hora de llevar a cabo un IQ, OQ y PQ.
Este artículo se publicó en GIT Labor-Fachzeitschrift, 7/2016, p. 14-18.
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