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Esterilización de líquidos, sólidos, desechos y sustancias con riesgo biológico

Sterilisation Flüssigkeiten
Esterilización de líquidos en botellas

¿Como se utiliza un autoclave correctamente?
El proceso de esterilización en autoclave (esterilizador a vapor) puede resultar muy complejo. Por ejemplo, si se esterilizan líquidos o sólidos (instrumentos, cristalería, filtros, textiles) para su posterior utilización en el laboratorio, el proceso de esterilización debe garantizar en todo momento un producto reproducible y estéril. Los productos que se esterilizan para su uso en el laboratorio no pueden someterse a pruebas de esterilidad ya que quedarían contaminados al realizar la prueba y, por lo tanto, ya no son utilizables en el laboratorio.

¿El autoclave perfecta para usted?

La validación de los procesos de esterilización por vapor es una cuestión cada vez más importante de cara asegura que los resultados son reproducibles demostrablemente. Además, los aspectos de seguridad deben tenerse muy en cuenta durante la esterilización a vapor, y muy especialmente durante la esterilización de líquidos. Por lo general, la esterilización se realiza a una temperatura de 121 ⁰C. Esto corresponde a una presión de vapor de aproximadamente 2 bar. Estas altas temperaturas y la presión asociada a ellas pueden suponer un riesgo considerable para el usuario si el proceso de esterilización por vapor se ha diseñado o realizado incorrectamente.

Esterilización de líquidos y residuos líquidos dentro de botellas
La esterilización de líquidos es una de las tareas más difíciles en el laboratorio. Los procesos de esterilización pueden llevar a veces mucho tiempo; las botellas deben estar abiertas o al menos ventiladas; algunas partes del líquido o el mismo líquido pueden sobre-hervir y las botellas pueden incluso llegar a estallar. Otra cuestión a plantearse es si los líquidos contenidos en las botellas verdaderamente han alcanzado la temperatura de esterilización deseada (p. ej., 121⁰C) y si pueden retirarse de la autoclave de forma segura una vez finalizado el proceso de esterilización.

Si observamos el proceso de esterilización de líquidos, vemos que consta de tres fases:



  1. Fase de calentamiento y tiempo de compensación (H)
  2. Fase de esterilización, p. ej., a 121 ⁰C durante 20 minutos (S)
  3. Fase de refrigeración a una temperatura de extracción segura (C)
Proceso de esterilización / Fases
Figura 1 – Proceso de esterilización / Fases

La figura 1 ilustra gráficamente las fases individuales.
En este caso, la línea azul representa la temperatura en el recipiente a presión de la autoclave, mientras que la línea roja representa la temperatura en el líquido. Se observa claramente que, en el recipiente a presión del autoclave, la temperatura deseada de 121°C se alcanza rápidamente, mientras que los líquidos de las botellas tardan mucho más tiempo en alcanzar la temperatura de esterilización. La energía calorífica del vapor se transfiere durante el tiempo de calentamiento por condensación del vapor en las botellas. Este proceso de condensación y la correspondiente transferencia de calor lleva algún tiempo, lo que explica la diferencia de tiempo entre el simple calentamiento del recipiente a presión y el calentamiento del líquido en sí. El tiempo necesario para alcanzar temperaturas iguales en el recipiente de presión de la autoclave y en los líquidos se denomina tiempo de compensación.
Muchas autoclaves usadas en laboratorios todavía no están equipadas con una medición de temperatura en un recipiente de referencia. De este modo, no se mide la temperatura exacta del líquido a esterilizar y, por lo tanto, no se puede utilizar para controlar el proceso de esterilización. Estas autoclaves inician el tiempo de esterilización cuando se alcanza la temperatura deseada en su recipiente a presión. El tiempo de compensación necesario para que los líquidos alcancen la temperatura deseada no se tiene en cuenta aquí. Los líquidos nunca alcanzan la temperatura de esterilización de, p. ej., 121 ⁰C y, por lo tanto, ya no se obtiene la eficacia biológica del proceso de esterilización. Dependiendo de la resistencia de los microorganismos que se desea inactivar, éstos sólo son inactivados nada o sólo parcialmente.

Medición de temperatura
Figura 2 – Medición de temperatura

Medición de temperatura en recipiente de referencia
Mediante la medición de la temperatura en un recipiente de referencia usando un sensor térmico se puede determinar la temperatura exacta del líquido a esterilizar y controlar el proceso de esterilización. El tiempo de esterilización se inicia sólo cuando se alcanza la temperatura de esterilización deseada en el líquido.
Para ello, el recipiente de referencia se llena primero con el agua necesaria para ello. Es importante que el tamaño y el nivel del recipiente de referencia correspondan al del recipiente más grande que se ha llenado con el líquido a esterilizar.

Temperatura de extracción segura
Por lo tanto, el sensor de temperatura para la medición en un recipiente de referencia es a fin de garantizar que se alcance la temperatura de esterilización en el líquido. Esto también es necesario para asegurar que una temperatura de extracción segura después de la esterilización. En una autoclave, los líquidos se calientan muy por encima del punto de ebullición normal (100 ⁰C). Debido al calor introducido en el líquido y a la sobrepresión asociada, pueden crearse peligros considerables para el usuario de la autoclave. Por ejemplo, puede producirse un retardo de la ebullición, es decir, el líquido comienza a hervir espontáneamente cuando se abre la autoclave. Esta ebullición espontánea genera una ola de vapor a presión y líquido caliente que sale de los recipientes como un géiser. ¡1 litro de agua genera 1000 litros de vapor! Debido a este potencial de riesgo significativo, los esterilizadores de vapor que se utilizan para la esterilización de líquidos deben cumplir las regulaciones correspondientes. La norma DIN EN 61010-2-040 estipula que los esterilizadores de vapor para la esterilización de líquidos deben estar equipados con dispositivos de seguridad que impidan la apertura de la autoclave mientras los líquidos no se hayan enfriado a una temperatura segura para el usuario. La norma define una temperatura de extracción segura de 20 K por debajo del punto de ebullición del agua a presión ambiental atmosférica. Esto corresponde a una temperatura de extracción segura de 80 °C. Las autoclaves modernas están equipadas con un sistema de cierre de la puerta que opera en función de la temperatura y la presión. Esto evita que la autoclave se abra mientras el depósito a presión esté presurizado y la temperatura medida en el líquido sea superior a los 80 °C.

Enfriar los líquidos a la temperatura de extracción segura puede tardar mucho tiempo. Un tamaño frecuentemente usado en autoclaves de laboratorio es una autoclave con una capacidad del depósito a presión de aprox. 150 litros. Si tal autoclave está completamente cargada con botellas que contienen el líquido a esterilizar, un ciclo completo de esterilización puede tardar hasta 10 horas. Esto significa que un proceso de esterilización no puede quedar completado ni siquiera en el plazo de un día laborable. Por lo tanto, es aconsejable equipar la autoclave con un sistema de refrigeración que reduzca significativamente el tiempo total del lote y elimine los peligros y desventajas adicionales durante la esterilización de líquidos.

Refrigeración rápida – Maximizar productividad y seguridad
En los sistemas de refrigeración disponibles para autoclaves, se debe distinguir entre dos tipos de sistemas de refrigeración.

  1. Refrigeración por evaporación – Mediante la ebullición del líquido en la fase de refrigeración
  2. Refrigeración por radiación – Mediante la radiación de calor desde el líquido, la ebullición del líquido no tiene lugar con este sistema de refrigeración.

La refrigeración por evaporación es probablemente el tipo de refrigeración más común en autoclaves. Este método a su vez puede ser:

  • Auto-refrigeración por la salida controlada del vapor
  • Refrigeración por ventilación – El aire frío del entorno se bombea desde el exterior al recipiente a presión con un ventilador.
  • Refrigeración con agua sin presión de soporte

Todos los tipos de refrigeración antes mencionados presentan graves desventajas a la hora de esterilizar líquidos y, si el proceso de esterilización no se realiza correctamente, puede presentar un considerable potencial de riesgo, ya que este tipo de refrigeración requiere que el líquido a enfriar haya hervido antes.

  1. Al hervir el líquido en la fase de refrigeración, parte del líquido se pierde. La pérdida esperada de líquido suele estar entre el 3 y el 10%, pero puede ser significativamente mayor dependiendo de los ingredientes del fluido. Especialmente cuando el contenido de proteínas en el líquido es alto, éste tiende a hervir más fuerte, lo que aumenta la pérdida de líquidos.
  2. Como los líquidos tienen que hervir para que se enfríen, existe una alta probabilidad de que vuelvan a alcanzar el punto de ebullición. Por lo tanto, las botellas se deben llenar sólo un tercio o la mitad, con el fin de evitar la sobre-ebullición. Por un lado, esto representa una pérdida considerable de productividad al perderse del 50 al 70% de la capacidad disponible (en las botellas). En segundo lugar, no es posible evitar fiablemente una sobre-ebullición. Si los líquidos sobrepasan el punto de ebullición, la autoclave deberá limpiarse a fondo hasta que, por ejemplo, los líquidos a base de agar puedan entrar en el sistema de tuberías (salida), bloqueándolo cuando el agar se enfríe y se solidifique. Limpiar el sistema de tubos del autoclave resulta luego muy costoso y sólo es posible a través del fabricante.
  3. La ebullición del líquido sólo es posible entonces usando botellas abiertas. Por lo tanto, las botellas tienen que estar abiertas o al menos ventiladas (tapa abierta ligeramente). Si el ventilado de las botellas se olvida o no se realiza correctamente, el líquido contenido en la fase de refrigeración no puede hervir y por lo tanto no se enfriará. Si el recipiente de referencia ha alcanzado la temperatura de enfriamiento de 80 °C y, por lo tanto, permite la apertura de la autoclave, la botella o botellas herméticamente cerradas se mantienen a la temperatura de esterilización con la presión correspondiente, por ejemplo a 121 °C y 2 bar. Esto supone un riesgo considerable, ya que estas botellas pueden explotar cuando se descarga la autoclave y el líquido contenido en ellas puede evaporarse espontáneamente, similar a lo que sucede con un retardo de la ebullición. ¡1 litro de agua genera 1000 litros de vapor!



EPor tanto, al adquirir una autoclave, es necesario definir al detalle para qué aplicaciones debe utilizarse y cómo debe equiparse en cuanto a productividad y seguridad.

Refrigeración con presión de apoyo
Figura 3 – Refrigeración con presión de apoyo

Refrigeración por radiación
La refrigeración por radiación (retro-refrigeración rápida con presión de apoyo) tiene ventajas considerables sobre la refrigeración por evaporación. En el caso de una refrigeración rápida con presión de apoyo, el depósito a presión se enfría mediante serpentines de refrigeración externos llenos de agua fría y distribuidos por toda su superficie. Antes de activar la refrigeración pasada la fase de esterilización, el vapor del recipiente a presión se sustituye por aire comprimido filtrado totalmente esterilizado. El aire comprimido impide de forma fiable que el líquido hierva en la fase de refrigeración. Luego, el calor se irradia desde el líquido a las paredes frías del recipiente a presión, provocando así que el líquido se enfríe.

La refrigeración rápida con presión de apoyo permite un aumento considerable de la productividad, ya que los tiempos de procesamiento se reducen considerablemente en comparación con la auto-refrigeración. Mientras que la auto-refrigeración requiere hasta 10 horas para una esterilización completa en el autoclave, el tiempo de retro-refrigeración puede reducirse hasta un 60% con la refrigeración rápida con presión de apoyo, siempre dependiendo de la capacidad de carga. Además, todos los peligros e inconvenientes descritos en el proceso de refrigeración por evaporación (distorsión de ebullición, pérdida de líquido, cocción excesiva, fallos de refrigeración con botellas herméticamente cerradas) se eliminan de forma fiable, ya que el líquido ya no hierve. En este tipo de refrigeración, las botellas deben llenarse hasta el nivel máximo (ganancia del 50 al 70% en la productividad) e incluso es posible utiliza botellas herméticamente cerradas. Una apertura o ventilado de la botella tampoco es necesario con este método.

Tiempos de procesamiento más optimizados


Las autoclaves modernas proporcionan la capacidad de optimizar la refrigeración de líquidos usando módulos. Esto aumenta la productividad todavía más, pero también afecta a la calidad de los líquidos a esterilizar. Y es que muchos líquidos contienen sustancias que no son muy estables al calor. Aunque los líquidos deban ser esterilizados, el tiempo durante el cual los líquidos están expuestos al calor debe mantenerse lo más corto posible para no afectar negativamente a los ingredientes sensibles al calor.


Módulo 1 – Ventilador centrífugo

Refrigeración con presión de soporte y ventilador centrifugo
Figura 4 – Refrigeración con presión de soporte y ventilador centrifug

Der Radialventilator erzeugt während der Kühlphase einen Luftstrom im Druckbehälter des Autoklaven. Dieser Luftstrom zwingt die Wärme aus den Flaschen an die durch die Schnellrückkühlung mit Stützdruck gekühlten Wandungen des Druckbehälters. Durch dieses Verfahren kann die Rückkühlzeit verglichen mit der Selbstabkühlung um bis zu 70% reduziert werden.

Modul 2 – Ultracooler
El Ultracooler es un intercambiador de calor adicional refrigerado por agua que se integra directamente en el recipiente de presión de la autoclave. Esto permite extraer el calor directamente de las botellas donde se encuentra. En el recipientes a presión. Gracias a la transferencia de calor significativamente mejorada, el tiempo de refrigeración puede reducirse hasta un 90% en comparación con la auto-refrigeración.
Nota: Dado que el ventilador centrífugo y el ultracooler están instalados en el interior del recipiente a presión, se debe asegurar que no reduzcan el espacio de trabajo disponible en la autoclave.

Esterilización de sólidos y residuos en bolsas
Al esterilizar sólidos (por ejemplo, instrumentos, cristalería vacía, puntas de pipeta en cajas, filtros y textiles) y/o destruir residuos en bolsas es importante asegurarse de que se crea una atmósfera de vapor exactamente donde se necesita. Es decir, dentro y alrededor del producto a esterilizar. Muchas autoclaves no eliminan el aire de forma fiable del dispositivo en sí ni del producto. Cuando el aire permanece en la autoclave y en el producto, no hay efecto esterilizante, ya que sólo el vapor es capaz de transportar la energía calorífica necesaria e inactivar los microorganismos fiablemente.

Ventilación ineficaz con sólidos
Figura 5 – Ventilación ineficaz con sólidos

Ventilación ineficaz
Las figuras 5 y 6 muestran esta ventilación ineficaz usando una caja con puntas de pipeta y una bolsa de destrucción a modo de ejemplos. Si la autoclave simplemente se calienta, el aire es expulsado de ella y se crea una atmósfera de vapor en su recipiente a presión, mientras que el aire permanece en el producto a esterilizar. El aire que queda en el producto evita que el vapor pueda penetrar donde se requiere su energía calorífica a fin de lograr un efecto esterilizante.

El aire a la misma temperatura del vapor (por ejemplo, a 121 ⁰C) contiene mucha menos energía calorífica. Para los productos que no se pueden esterilizar en atmósferas de vapor, hay esterilizadores de aire caliente, pero estos esterilizan a temperaturas más altas (180 a 250 ⁰C) y por un período de tiempo mucho más largo (hasta varias horas de esterilización). Un efecto esterilizador con aire a las temperaturas típicamente utilizadas en esterilizadores de vapor de 121 °C hasta 134°C y con tiempos de esterilización de 3 a 20 minutos es por tanto algo prácticamente inexistente.

Ventilación ineficaz con líquidos
Figura 6 – Ventilación ineficaz con líquido

Ventilación efectiva
Para la eliminación total del aire de forma completa y reproducible en la autoclave y en el producto a esterilizar es necesario aplicar un pre-vacío fraccionado. Para ello, la autoclave está equipada con un sistema de vacío propio. Durante la fase de calentamiento se producen ciclos de vacío con los que el aire es eliminado activamente, lo que va seguido de choques de vapor. Usualmente se utiliza un pre-vacío fraccionado triple, pero dependiendo del producto pueden ser necesarias más fracciones

Secado de sólidos – Superdry
Para el secado, los sólidos, como los instrumentos o la cristalería vacía, se suelen colocar en un armario de secado después del proceso de esterilización. Las autoclaves modernas permiten el secado de los sólidos inmediatamente después del proceso de esterilización. Así se consigue esterilización y secado en un proceso. Además esto evitar tener que seguir manipulando el material a esterilizar con el riesgo de re-contaminación que ello conlleva.

Ventilación completa
Figura 7 – Ventilación completa

Esterilización de sustancias biológicas peligrosas
La esterilización de sustancias que presentan riesgos biológicos es un desafío especial. Durante la fase de calentamiento, el aire de la autoclave se sustituye por vapor. Para este propósito, el aire es expulsado de la autoclave y liberado a la sala en la que está instalada.
La TRBA 100 (Reglas Técnicas para Agentes Biológicos) exige que el aire de salida del proceso de una autoclave en laboratorios reciba tratamiento a partir del nivel de seguridad S2 en adelante, ya que este aire de salida podría estar contaminado con microorganismos del producto esterilizado. Para ello, se debe usar por tanto un método adecuado. En las autoclaves se recurre normalmente al método de filtración. Para ello, la autoclave está equipada con un sistema de filtros de escape. Todo el aire desplazado del autoclave pasa por el filtro y los microorganismos se retienen en él. El filtro será esterilizado en línea durante el proceso de esterilización para inactivar los microorganismos que contiene.

La TRBA 100 sólo se refiere a la salida de los gases de escape autoclave, pero no a las sustancias condensadas. Durante el proceso de esterilización, el vapor se condensa sobre el producto y se convierte en agua (condensación). Esta agua también puede estar potencialmente contaminada por microorganismos. Por lo tanto, el condensado debe permanecer en la autoclave durante el proceso de esterilización y también debe ser esterilizada “en línea” antes de descargarla al desagüe después de una esterilización exitosa.

Cualificación y validación
Durante el proceso de cualificación, se comprueba si un producto es apto para el uso previsto y si un proceso, por ejemplo, un proceso de esterilización, puede completarse con el mismo resultado y teniendo en cuenta el producto a esterilizar (reproducibilidad) para obtener un producto estéril.

Básicamente, el proceso de calificación se divide en tres partes principales:

  1. IQ – Cualificación de la instalación
    Evaluación de si se ha fabricado e instalado un dispositivo de acuerdo con las especificaciones correspondientes.
  2. OQ – Cualificación operativa
    (Operational Qualification) 
Evaluación de si un dispositivo funciona de acuerdo con las especificaciones correspondientes.
  3. PQ – Cualificación del rendimiento
    Evaluación de si un dispositivo trabaja con el producto a procesar según las especificaciones..

El objetivo de la cualificación y validación es la prueba documentada de que un producto es apto para el uso previsto.

El efecto esterilizante de un proceso de esterilización por vapor se demuestra en la fase de OQ (cámara vacía) y de PQ (con producto) mediante dispositivos de medición de temperatura y presión externos, así como mediante bioindicadores basados en Bacillus Stearothermophilus. Mientras que los dispositivos de medición de temperatura y presión externos aportan la prueba de que el sistema de control de la autoclave indica y documenta valores fiables y lleva a cabo el proceso de esterilización dentro de las tolerancias, los bioindicadores proporcionan la prueba de su eficacia biológica. Para fijar los bioindicadores es necesario determinar en qué áreas del producto a esterilizar es más difícil lograr la eficacia biológica. Los bioindicadores deben colocarse precisamente en estas áreas para cubrir el peor de los casos, por así decirlo. Todos los pasos de IQ, OQ y PQ se deben documentar detalladamente. En cualquier caso, es necesaria una estrecha coordinación entre el usuario y el fabricante al implementar procesos IQ, OQ y PQ.

Este artículo fue publicado en GIT Labor-Fachzeitschrift, 7/2016, p. 14-18. 

 

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